孢子萌发对于细菌定殖是必要的第一步，孢子在结肠中的萌发速率依赖于宿主菌群的组成，宿主菌群可调控初级及次级胆盐水平以控制艰难梭菌的孢子萌发。Biosensors and Bioelectronics上发表了一项最新研究，基于萌发的孢子有着更高的净电导率这一特征，开发了一种基于阻抗检测的高通量单细胞计数法（Ampha Z32阻抗流式细胞仪，瑞士Amphasys），仅需4小时（传统方法需24小时）即可评估艰难梭菌的孢子萌发情况，并可用于评估宿主菌群对艰难梭菌感染的易感性。
① 利用高通量单细胞阻抗计数法（>300 events/s）对活细菌细胞进行定量；
② 相比于传统的菌落分析方法（需24h），该方法仅需培养4h即可评估孢子萌发情况，检测下限为每50μL样本中约100个活细胞；
③ 萌发的艰难梭菌孢子有更高的净电导率，这在中等导电介质（0.8S/m）内造成了独特的高频（10 MHz）阻抗相分散（活细胞与失活细胞离散）；
④ 该方法可对比在不同的初级胆盐水平下的艰难梭菌孢子萌发速率，并可用于评估宿主对艰难梭菌感染的易感性。
图1（a） 艰难梭菌孢子萌发到其营养体形式受到“正常”菌群中共生细菌的抑制，该菌群分泌水解酶，能够代谢初级胆盐为次级胆盐，而缺乏共生细菌的抗生素破坏菌群表现出较高的初级至次级胆盐水平，导致孢子萌发增强；（b） 整体实验时间表：包括孢子预处理、细菌生长、IFC（阻抗流式细胞仪）微流控表型分析和菌群验证；（c）阻抗式细胞仪分析的具体样品制备步骤；（d） 来自抗生素处理的小鼠模型的宿主菌群样本的采集、制备和分析步骤。图2 艰难梭菌UK1孢子在不同水平牛磺胆酸盐的标准生长培养基中培养后的微生物学分析图2（a） 24小时内的生长曲线显示，随着牛磺胆酸盐水平的增加，孢子萌发率逐渐提高，由于营养性艰难梭菌的存在， 0.001% 、0.01%和 0.1%牛磺胆酸盐水平下的吸光度分别在20h、18h、15h（用虚线标记）与无牛磺胆酸盐的对照组的吸光度相比，出现显著差异（*p<0.05）；（b） 24小时后的CFU分析结果显示，含有0.1%牛磺胆酸盐的生长培养基的孢子萌发显著（****p<0.0001），而其他牛磺胆酸盐水平下孢子萌发并不明显；（c）培养4小时后的DEP归一化光谱和频谱结果显示，含有0.1%牛磺胆酸盐的DEP归一化光谱与同质营养体艰难梭菌匀质样品的DEP归一化光谱（实线）极为相似，根据异质样本的净电生理特性可以推断，在0.1%牛磺胆酸处理的样本中存在营养体艰难梭菌亚群，这与传统法分析（图2a和b）的评估结果一致，但检测可在更短时间内进行（4小时.VS >15小时）。图3 营养体艰难梭菌细胞和孢子的多壳层介电模型&均质种群的归一化DEP光谱
图3（a） 基于营养体细胞和孢子的大小、形状和结构差异，生成多壳层介电模型；（b） 营养体细胞和孢子均质种群的归一化DEP光谱结果表明，不同样品类型的极化和电生理特性存在明显差异。低于100 kHz的电场频率下，营养体艰难梭菌细胞因绝缘细胞外壳表现为nDEP（负DEP），但在高于1 MHz的电场频率下，营养体艰难梭菌因细胞内部的导电细胞质而发生极化，表现出pDEP（正DEP）。图4 不同频率、介质电导率下，艰难梭菌活细胞营养体与热灭活后的艰难梭菌细胞的阻抗数据（相位-振幅）叠加图（IFC法）由于孢子萌发过程中样品的异质性，研究可利用Ampha Z32阻抗流式细胞仪（IFC法）通过检测营养体艰难梭菌的电生理学特征来鉴定孢子萌发，并量化营养体艰难梭菌的比例。图4为不同频率（0.5 MHz (a & d)、2 MHz (b & e)、10 MHz (c & f)）、不同介质导电条件（0.5× PBS（a-c）、1× PBS（d–f) ）下，艰难梭菌活细胞营养体与热灭活后的艰难梭菌细胞的阻抗数据（相位-振幅）叠加图。对比可知，0.5× PBS（介质电导率为 0.8 S/m），10 MHz 下二者的区分度最佳，筛选门控可设于218°相位处（图4c实线），此时艰难梭菌活细胞占比＞95%。图5 不同牛磺胆酸盐水平、不同培养时间下艰难梭菌活细胞的占比（IFC法：0.5× PBS，10 MHz）图5显示孢子萌发率随生长培养基中牛磺胆酸盐水平以及萌发时间的增加而增加，其中0.1% 牛磺胆酸盐的生长培养基中培养 4 小时后，孢子萌发率约为 30%（每50μL 样品约 250 个营养体艰难梭菌细胞），而0.05–0.1%牛磺胆酸盐的生长培养基中萌发 5 小时后，孢子的萌发率可达80%以上；该测定结果表明艰难梭菌对培养时间和生长培养基中初级胆汁盐（牛磺胆酸盐）比例的变化表现出良好的敏感性。图6 未处理和抗生素处理的艰难梭菌孢子萌发实验比较（宿主菌体外菌群）本研究使用从小鼠模型获得的体外菌群样品进一步验证了实验结果的可靠性。在使用克林霉素进行抗生素治疗10天后，按照图1d的步骤进行了艰难梭菌孢子萌发实验。CFU分析（图6a）结果显示，未经处理的菌群的孢子发芽率明显较低，而克林霉素处理的菌群培养24小时后，孢子萌发水平显著提高（**p<0.01），表明抗生素处理后菌群多样性的减少可能会提高艰难梭菌的萌发率，这与此前的研究结果一致。而使用阻抗流式细胞仪（IFC法）在培养4小时后即可检测出未处理和抗生素处理的艰难梭菌孢子萌发率（***p<0.001，图6b）和孢子数量（**p<0.01，图6c）上的显著差异。这表明与CFU法相比，IFC法具有更高的灵敏性，可以更早检测出宿主菌群对艰难梭菌孢子萌发的敏感性差异（4h与 24 h）。综上所述，Ampha Z32阻抗流式细胞仪（IFC法）可用于识别艰难梭菌营养体，量化宿主菌群对艰难梭菌孢子萌发率的影响，并在较短时间内检测出宿主菌群对艰难梭菌孢子萌发的敏感性差异。该方法检测灵敏度高、测量快速、样品制备简单，有潜力进一步用于CDI临床测量的基准测试，调查抗生素治疗下肠道菌群随时间变化的敏感性差异，并通过初始和复发艰难梭菌感染的易感性指导临床管理决策。John H. Moore et al. Quantifying bacterial spore germination by single-cell impedance cytometryfor assessment of host microbiota susceptibility to Clostridioides difficileinfection. Biosensors and Bioelectronics, Volume 166, 2020, 112440, ISSN0956-5663.
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