肿瘤患者来源的异种移植(PDX)是进行化疗药物敏感性和毒性评估的有效手段，对预测化疗疗效至关重要。细胞凋亡或程序性细胞死亡可为吞噬细胞清除细胞提供重要信号，也可调控广泛微环境中细胞信号转导。细胞凋亡首先在细胞表面形成质膜泡，随后产生薄膜包埋，包括质膜上的微管峰、凋亡和珠状结构，最终导致细胞分裂和细胞物质分布到亚细胞体和小微泡中。所有这些具有不同大小、形状和内部组成的膜结合凋亡细胞外小泡（1-5μm）统称为凋亡小体（ABs）。在药物处理下分泌到培养基中的亚细胞凋亡小体(ABs)和微泡（MVs），可作为药物敏感性的标志物。目前，实体瘤的体外药物敏感性评估主要通过：一、对贴壁细胞进行显微镜镜检分析ABs细胞的数量和形状；二、流式细胞仪测量统计凋亡条件下ABs和细胞的数量，并根据荧光染色结果鉴定细胞大小并进行分类。然而由于ABs复杂多样，很难确定每种AB型的适配荧光染料并预估ABs对不同染料渗透动力学的依赖性，因此利用流式细胞仪量化细胞分解过程存在极大的挑战。阻抗流式细胞仪（Ampha Z32，Amphasys AG）作为一种测量单细胞电生理学特性的有效工具，已广泛应用于无标记高通量无损评估细胞的活力与数量。近期，美国弗吉尼亚大学的科研人员利用阻抗流式细胞仪Ampha Z32测定分析了经吉西他滨处理的胰腺肿瘤培养基上清液中ABs，所得测量结果（高频阻抗相位与大小分布）与常规方法提取出的凋亡细胞所表现出表型特征一致，结合介电质多壳模型还可用于ABs分类（基于尺寸和形状），如：具有低阻抗相位（＜0.3）的＜2.6μm小球形囊泡；具有高阻抗相位（＜0.5）的中等尺寸扁球形囊泡（3-8μm）；以及可能由球形或长形囊泡产生的具有低阻抗相位（＜0.3）的较宽尺寸囊泡（3-14μm），这是常规流式细胞仪（FACS Calibur，BD Biosciences）所不能实现的。可见，阻抗流式细胞仪（Ampha Z32，Amphasys AG）可作为检测胰腺肿瘤微环境模型培养基中的ABs的有效工具，准确评估患者源性肿瘤对化疗药物的药物敏感性和毒性。
图1 A）建立胰腺癌（PDAX）患者来源的异种移植模型测定对吉西他滨的药物敏感性；B）阻抗流式细胞仪（Ampha Z32，Amphasys AG）检测示意图；C）吉西他滨诱导凋亡细胞解体产生的各种表型和形态的凋亡小体ABs
图1B 阻抗流式细胞仪（Ampha Z32，Amphasys AG）信号的采集和转导A）细胞在不同频率的交流电场中的检测结果，低频下反映细胞的体积特性，高频下反映细胞膜的介电特性即细胞活性；B) 微流控芯片；C）流经交流电场的细胞的阻抗信号（蓝色实部即电阻信号，绿色虚部即容性电抗信号），细胞膜完整性决定容性电抗的大小，故可通过虚部信号来区分活细胞和死细胞，最终以阻抗相位角-振幅散点图反映出来阻抗流式细胞仪（Ampha Z32，Amphasys AG），通过检测流经交流电场的细胞悬浮液中细胞的电阻抗信号，分析获得细胞的数量、大小、活性。该仪器可以在0.3-30MHz的范围内同时测量4个不同频率下细胞的电阻抗特性，适配微流控芯片通道尺寸范围为15-400μm（图1B），可满足0-300μm范围内的任意生物、非生物单细胞的活性测量。电场中活细胞的等效电路由电阻（细胞质）和电容（细胞膜）组成，在笛卡尔坐标系中，阻抗Z（ω）可以描述为实部分Zr（ω）或电阻与虚部分Zi（ω）或容性电抗的矢量和。
图2 流式细胞仪（FACS Calibur，BD Biosciences）评估吉西他滨诱导下PDAC细胞系的凋亡变化
其中图2A）显示了暴露于不同浓度（0.01、0.1和1 μg·mL-1）吉西他滨下的PDAC细胞系在不同处理时间[24 h（●）、48 h（■）和 96 h（▲）]的相对于对照组的增值状态（%）。从图中可以看出，0.01 μg·mL-1的药物浓度下，短时间内（24 h和48 h）几乎对细胞增殖无影响，而0.1和1 μg·mL-1的药物浓度下48h和96h后，细胞增殖水平急剧下降至≈-50%。也就是说随药物剂量增加和暴露时间的延长，细胞增殖下降，这说明吉西他滨对PDAC细胞系有化疗效果。图2B)为不同浓度吉西他滨下暴露48h后的PDAC细胞显微图像（63 obj，2.5optovar，Zeiss Observer 7），其中凸起（0.01 μg·mL-1）、气泡（0.1 μg·mL-1）及珠状结构（1 μg·mL-1）均为细胞凋亡过程的关键特征，会进一步形成具有特定组成和结构的ABs。图2C)对不同浓度吉西他滨下暴露48h后的PDAC细胞进行流式细胞分析所得到细胞（i-iv）和亚细胞（v-viii）的密度散点图。其中膜联蛋白V (AnnexinV)与DAPI作为染色标记物。图中AV-DAPI-门控内为未染色的活细胞；AV＋DAPI-门控内为细胞膜完整的处于凋亡早期至中期的细胞；DAPI＋门控内为具有通透性膜的失活细胞。图2D)和E)分别为不同浓度不同暴露时间下，细胞（Cells）和亚细胞（Sub-Cells）中AV-DAPI-、AV+DAPI-和DAPI+门控中的亚群占比。其中在高浓度吉西他滨治疗条件下（48 h，0.1和1 μg·mL-1），DAPI+细胞的比率降低，其中AV＋DAPI-细胞（即早期/中期凋亡细胞）的比率显著增加（图2D），表明此时药物开始诱导的细胞凋亡；AV＋DAPI-亚细胞比例从≈10–30%上升至≈60%（图2E），这可能对应于凋亡细胞分解过程中产生的较大的ABs。图2C-vii、viii中的箭头指示出不同的ABs亚型，但由于遗传物质和膜构象的差异，不同ABs亚型需要适配不同的染色剂，故很难通过流式细胞仪进行具体区分。
图3 阻抗流式细胞仪（Ampha Z32，Amphasys AG）评估吉西他滨诱导下PDAC细胞系的凋亡变化图3中A-D分别为不同浓度（0、0.01、0.1和1 μg·mL-1）的吉西他滨下暴露于48 h后的PDAC细胞电直径与阻抗相位的密度散点图。其中，阻抗流式细胞仪在低频电场(0.5 MHz)下测量得到的细胞阻抗振幅(IZI)可用于评估细胞的电直径（），而在高频电场（18 MHz）下的阻抗相位（）则可用来评估细胞的介电特性，7 μm聚苯乙烯珠的电直径-阻抗相位值可作为参考设置细胞和亚细胞门控。图E）和F）分别显示了在不同浓度药物下，阻抗流式细胞仪和流式细胞仪分析获得的细胞和亚细胞的占比，从图中可以看出，0.1和1 μg·mL-1药物水平下的细胞占比显著下降（*p<0.05），这是由于药物治疗下，PDAC细胞凋亡并促使亚细胞凋亡小体ABs的释放。
图4 A-C分别为不同药物浓度、不同暴露时间下，A）细胞亚群的占比的变化；B）细胞的阻抗相位变化以及C）亚细胞的阻抗相位变化；D）细胞与E）亚细胞的归一化阻抗相位（φZ18 MHz）分布趋势（对照组与暴露于1 μg·mL-1吉西他滨下24 h和48 h的处理组，以7 μm聚苯乙烯珠在18 MHz下的阻抗相位（φZ18 MHz）为参考进行标准化处理）；F）暴露于不同浓度吉西他滨下24 h和48 h的细胞和亚细胞与对照组的差分阻抗相位比较。从图中可以看出，细胞及亚细胞阻抗相位均随着药物浓度升高及暴露时间的延长而降低，这是由于随细胞的凋亡，细胞内部电导率（σint）下降，从而反映出细胞阻抗相位的下降，这与使用双相电泳观察到的凋亡细胞所反映出的状态一致，这种效应可能与细胞凋亡过程中细胞内离子（主要是K+和Na+）的流出有关。特别值得注意的是，阻抗流式细胞仪（Ampha Z32，Amphasys AG）对细胞凋亡过程的捕捉比流式细胞仪更为灵敏，其可在较低药物浓度（和暴露时间）下检测出细胞阻抗相位的变化（图4D、E与图2C、D）。总体来看，细胞和亚细胞的归一化阻抗相位（图4D、E）分布趋势相似，但亚细胞群体的阻抗相位下降幅度更大，这说明两个类群的表型相似，但亚细胞对凋亡的发生更加敏感。根据阻抗相位的变化，或可进一步进行各种ABs亚型，如：较小的微泡、ABs珠状聚集体和细胞解体产生的较大ABs（图1C）的分类研究。
为优化阻抗流式细胞仪（AmphaZ32，Amphasys AG）单细胞检测的信噪比，以识别不同ABs亚型的电生理学的差异，本研究利用5μm聚苯乙烯参考珠的检测结果进行尺寸标准化，并结合单一频率的（10 MHz）阻抗相位和电直径结果绘制了对照组（图5A）和1 μg·mL-1吉西他滨处理组（图5B）的ABs电直径-阻抗相位3D密度分布图。对比可见，对照组与处理组细胞数量存在显著差异（图C，**p＜0.01），且处理组含有三个不同ABs亚群：低阻抗相位的小囊泡（＜0.3）、高阻抗相位的中型亚细胞体（＞0.5）和低阻抗相位的较大尺寸的亚细胞体（＜0.3）。流式细胞仪的检测结果同样显示出对照组与处理组细胞数量间的显著差异（图F，**p＜0.01），但却无法从FSC、SSC或膜联蛋白V染色结果进行ABs亚群尤其是较大尺寸（中值电直径＞2.6 μm）亚群的区分（图5D，F）。
暴露于1 μg·mL-1吉西他滨下48 h的处理组ABs在10 MHz下的阻抗相位分布如图中图6A）和B）中实线所示。为对ABs表型进行准确分类，本研究通过单一高斯分布（图6A，A-1高斯模型R2=0.9686）来拟合确定＜2.6 μm的ABs亚群的阻抗相位分布的峰值位置（0.28），通过双高斯分布（图6B虚线，B-2高斯模型R2=0.9852）拟合确定电直径＞2.6 μm的ABs亚群（对应图5B的两个亚群）阻抗相位分布的峰值位置（0.29和0.59）。显微镜观察到亚细胞体呈球形、扁长形和扁圆形（图1C）等多种亚型，形状因细胞系、药物诱导等因素而异。我们虽然很难通过阻抗流式细胞仪直接识别出这些形状特征，但却可以利用不同形状对电极化的强烈影响而产生的阻抗数据差异进行形状的区分。本研究基于ABs球形度-电直径变化所引起的阻抗相位（φZ10 MHz）的变化创建了ABs表型的介电多壳模型，该模型（图6C）可显示特定大小和形状下的ABs阻抗相位（φZ10 MHz）的差异，其中有低阻抗相位（＜0.3）的＜2.6μm的为小球形囊泡，高阻抗相位（＜0.5）的中等尺寸扁球形囊泡（3-8 μm），以及可能由球形或长形囊泡产生的具有低阻抗相位（＜0.3）的较宽尺寸的囊泡（3-14 μm）。此研究表明，阻抗流式细胞仪可高通量快速无损评估患者源性肿瘤细胞对药物的敏感性，不仅免除了费力耗力的细胞收集和染色标记过程，还可避免因染色不当所造成的细胞凋亡。除此之外，阻抗流式细胞仪还可在不同的肿瘤微环境模型和药物类型下通过追踪ABs表型来确定细胞凋亡过程，以更准确的衡量药物敏感性和毒性。Carlos Honrado, Sara J. Adair, Nathan S. Swami, et al. ApoptoticBodies in the Pancreatic Tumor Cell Culture Media Enable Label-Free DrugSensitivity Assessment by Impedance Cytometry. Adv. Biology 2021, 2100438
