提速小麦单倍体技术产业化进程——原创小麦单倍体花青素标记鉴别系统
日期：2023-03-08 17:31:35
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，为人类提供约20%的食物热量。随着全球人口的增加，2050年小麦产量需要提高70%，培育优良品种是提高产量的有效途径。然而，使用传统方法非常耗时，培育一个新的小麦品种通常需要至少8-10年。但通过双单倍体（Doubled Haploid，DH）育种技术的运用，纯系只需1-2个世代即可产生，显著缩短育种周期，大大加快了育种进程。DH系生产包括3个环节，即单倍体诱导 、单倍体加倍和DH系繁殖与鉴定，每个环节都对纯系的生产效率至关重要。
在小麦单倍体诱导环节，前期中国农业大学团队研究团队通过敲除玉米单倍体诱导关键基因ZmPLA1的同源基因，率先在小麦中建立了单倍体诱导(haploid induction, HI) 技术体系，单倍体诱导效率高于20%。小麦单倍体技术体系虽有了高效的诱导技术，但是该技术的应用仍需解决小麦单倍体鉴别等问题，开发高效的标记是实现小麦单倍体鉴别(haploid identification, HID) 的核心。2023年3月1日， Plant Communications在线发表了中国农业大学陈绍江、刘晨旭团队题为“Establishment of an efficient haploid identification system by engineering anthocyanin accumulation in wheat embryo”，该研究利用玉米花青素调控基因ZmC1和ZmR，成功创制了小麦紫胚芽鞘诱导系PCI和紫胚诱导系PEI，实现了小麦单倍体的精准鉴别，并利用PEI诱导系成功创制了DH系，展现了该技术在小麦育种中的应用前景。前人研究表明ZmC1和ZmR可以调控植物花青素合成，中国农业大学研究团队为了测试使用ZmC1和ZmR进行小麦HID的可行性，评估了转基因品系AL-30和AL-40的色素沉着情况，这些品系分别含有pUbi驱动的ZmC1和pUbi驱动的ZmR。AL-30和AL-40在胚胎和种皮分别出现色素沉着（图1A）。除此以外，在胚胎或胚乳中没有发现AL-30、AL-40和野生型之间的差异。接下来，通过将AL-30和AL-40杂交，研究团队创造了一个同时具有ZmC1和ZmR的F1。结果表明，成熟的胚胎（ME），未成熟的胚胎（IE）和F1果核的外胚层都显示出深紫色色素，表明ZmC1和ZmR能协同促进花青素的积累(图1A）。然而，ZmC1和ZmR的同时过表达也导致导致叶片强烈的色素沉着，严重阻碍了幼苗的生长，最终导致死亡。因此，不能简单地将pUbi驱动的ZmC1和ZmR用于小麦的HID。研究团队将组成型表达ZmC1的材料AL-30与诱导系进行杂交，通过分子标记与表型辅助选择，育成了紫胚芽鞘诱导系PCI。利用该诱导系杂交的后代，根据胚芽鞘颜色可实现单倍体精准鉴别（图1B-C），单倍体鉴别准确率为96.3%（图1G-H）。图1 中国农业大学研究团队建立的高效小麦HID系统为了在种子阶段实现可视化的HID，研究团队确定了一个胚胎偏好的启动子Oleosin-like基因—TaOle。TaOle的1419bp启动子片段与ZmR和ZmC1的CDS融合，构成pTaOle驱动的ZmR-P2A-ZmC1表达载体（图1D）。将该载体被转化到小麦单倍体诱导系TaPLA-4A和TaPLA-4D中，结果表明所有四个阳性转基因植株在IE和ME中都显示出深紫色的色素沉着，但在其他组织中没有染色，表明pTaOle在转基因植物的胚胎中工作良好（图1E）。更重要的是，这些转基因植物的生长和发育没有受到影响，这是对AL-30和AL-40的F1杂种的巨大改良。在T1代中，具有ZmR-P2A-Zm纯合基因型的个体被筛选并命名为紫色胚胎诱导系（PEI）。为了测试HID的性能，我们用CS、JW1和MR-H的胚胎供体植物与花粉来自同源的T1 PEI植物的花粉杂交。根据IE和ME中色素沉着的缺失情况，筛选出推测的单倍体（图1F），并通过流式细胞仪和表型进一步验证（图1G）。在IE阶段，有11个和9个推定的单倍体分别来自CS和JW1，后被验证为真正的单倍体；在ME阶段，有2个、6个和3个假定的单倍体分别来自CS、JW1和MR-H。倍性分析的结果显示分析结果显示，只有MR-H的一个推定单倍体被发现是二倍体（6N）。为了进一步评估HID的准确性，在T2代中筛选了13个假定的CS单倍体，所有这些都被证实是真正的单倍体。因此，在IE和ME阶段的总体HID准确性为97.7%（图1H）。同样的方法用于验证18个假定的二倍体(6N）的紫色胚胎，所有这些胚胎都被确认为真正的二倍体（6N）。上述结果表明，PEI可以实现小麦的高效HID。此外，研究团队将F1杂交种（CS×Fielder）与PEI杂交，产生单倍体用于染色体加倍。总共获得11个单倍体，所有的单倍体在秋水仙素处理后都加倍了。为了研究DH是否在所有的染色体上都是纯合的，用靶向测序技术对11个DH的基因组进行了基因分型。9158个单核苷酸多态性（SNPs）的生物信息学分析显示，没有一个DH携带杂合的位点（图1I），表明PEI可以诱导纯合子，并可能成为小麦DH育种的一个前景广阔的工具。该研究原创的小麦单倍体花青素标记鉴别系统，为新型小麦单倍体育种技术从理论研究到实践应用迈出了一大步，提速小麦单倍体技术产业化的进程，对于加快小麦育种进程具有里程碑式的意义。综上所述， DH育种因具备周期短、纯度高等优点，获得了国内外各大农业公司及育种单位的密切关注。对于种业公司来说，早日推出优异新品种就可以早日获取效益，而对于育种家们来说，缩短育种周期、加快育种速度是他们毕生的奋斗目标。随着单倍体诱导关键调控基因的进一步挖掘和基因编辑技术的联合使用， DH育种技术已经不仅仅局限在玉米纯系的创制上，其应用也由玉米拓展到单子叶作物水稻、小麦、谷子，以及双子叶拟南芥、蒺藜苜蓿、番茄、烟草等多种植物上，未来 DH育种技术在作物育种和改良上将发挥更大的作用，粮食作物以及蔬菜经济作物工厂化应用将很快到来。Qi X, Guo S, Zhong Y, et al. Establishment of an efficient haploid identification system by engineering anthocyanin accumulation in wheat embryo. Plant Communications, 2023, 100568.
北大荒垦丰种业-尊龙凯时 - 人生就是搏!科技生物技术与表型服务中心是由北大荒垦丰种业股份有限公司和上海尊龙凯时 - 人生就是搏!科技股份有限公司共同建设的开放式高通量植物基因型-表型-育种服务平台。中心建立了基因克隆和载体平台、作物转化系统、基因型分析平台、表型鉴定分析平台、数据分析和利用平台等现代化生物技术和信息支持平台，是定位于为植物科研和作物育种提供植物基因型-表型-育种数据分析的科研服务平台。为了缩短您的育种进程，提高您的育种成功率，北大荒垦丰种业尊龙凯时 - 人生就是搏!科技生物技术与表型服务中心将为您提供一体化DH生产服务。我们提供DH服务技术流程：从实验室——温室——田间一体化服务。父本诱导系诱导母本材料，孤雌生殖，产生单倍体种子（幼胚）。20-60份/皿。置于人工培养室（带光照层架）或人工培养箱中培养48小时左右。将幼胚在体视荧光显微镜下观察或者在日光灯下观察，以自交系所得幼胚为对照。因为杂合二倍体含有父本基因，所以单倍体有微弱荧光或无色。将挑选的拟单倍体直接置于含有加倍药剂（秋水仙素）的MS培养基上，暗培养；后转入不含加倍药剂的MS培养基，暗培养后光照培养，待幼苗2叶一心时移至培养瓶中（MS培养基）。将培养瓶中DH系幼苗在4叶一心时移栽至苗钵，在温室中炼苗。待幼苗5-6叶期移栽至温室花盆或大田，待散粉时，及时套袋进行自交授粉。田间收获和鉴别。如果用采用花药离体培养单倍体的方法，则省去观察幼胚的步骤，其余步骤基本相同。花粉作为一种重要的种质资源，被广泛利用到科学研究、新品繁育、农业研究、种子生产等领域中。通常，花粉容易受到光照、温度、湿度等环境因素的影响，因此花粉活力检测是育种和农业生产过程中必不可少的检测指标。筛选高活性的花粉进行授粉可以提高作物结籽率、果品品质，提高产量预测的准确性，进而减少农业生产过程中不必要的损失。传统上进行花粉活力检测主要通过染色法和体外萌发法，然而这两种方法费时耗力、通量低、适用性及统计性差，往往不能满足育种、生产过程中的日常需求。花粉活力分析仪通过检测流经交流电场的花粉颗粒的电阻抗特性，实时获取大量花粉颗粒的大小、活性、浓度等数据。该方法已应用于上百种植物花粉活性的检测，是一种高效、可靠且标准化的检测技术。尊龙凯时 - 人生就是搏!科技AgriPheno平台已引进Ampha™ Z40花粉活力分析仪并向广大育种家和农业生产者推出花粉活力的检测分析服务。DH育种是利用诱导系诱导（或花药离体培养等手段诱导）产生单倍体植株，再通过染色体组加倍（自然加倍或药剂处理）使植物恢复正常染色体数的育种方法。由于自然单性生殖或孤雄生殖单倍体非常罕见，因此单倍体的获得成为单倍体育种的一个难点，游离小孢子培养是获得单倍体的重要手段之一。花粉活力分析仪（阻抗流式细胞技术，IFC）可以在DH育种过程中，帮助选择小孢子植物供体，评估小孢子胚诱导策略，优化培养条件，并在小孢子培养早期进行产胚量的准确预测，可显著提高游离小孢子培养的成功率，进而加快DH育种的效率。花粉的形成受到遗传因素的严格控制，而当控制花粉发育的基因发生突变时将导致花粉质量降低、花粉数量减少或是完全没有花粉。杂交育种过程中，花粉败育的雄性不育系是理想的母本，而任意环境下具备大量高活性花粉的雄性可育系则是理想的父本。花粉活性通常会受到光、热温度、农药等环境因素的影响，可以通过不同条件下花粉的活性来确定花粉生长的理想条件，或筛选优质、高抗品系。下图为五种不同植物花粉对温度变化的响应，如图所示，某些花粉是可以暴露在50℃的高温下的（粉色），而其他花粉则在45℃就逐渐失活。这表明每一种花粉都有其理想的生长温度，获得高活性花粉不能超过其理想生长温度。育种和生产过程中，通常会遇到花期不育的问题，这就需要提前采集花粉，保存备用。但自然条件下，绝大多数植物花粉的寿命都较短，而且容易受温度、光照等因素的影响，因此，何时收获花粉，收获后如何保存并维持花粉的活力则至关重要。未开放的花苞（左）和刚刚开放的花朵（中），花粉具备活性，当花蕊完全伸展后（右），花粉则不再具备活性。真菌孢子细胞与花粉粒具有高度相似性，因此也可以进行类似的活性检测，目前已检测过的细胞有细菌、酵母、藻类、动物、人体等单细胞。下图为不同来源的酵母活性的对比，如图所示，鲜酵母活性较高；，而干燥酵母，即使于室温下培育1小时，它的活性仍然比新鲜酵母低；取自啤酒的酵母细胞活性较差。如您需要了解更多信息，请点击或扫描下方二维码填写登记表，我们会为您提供专业的服务，真诚期待与您的合作！
