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作者：Ying Tan, Quan Sheng Zhang（张全胜，通讯作者）, Wei Zhao, Zhe Liu, Ming Yu Ma, Ming Yu Zhong, Meng Xin Wang（烟台大学海洋学院）

时间：2019年7月25日

期刊：Photosynthesis Research

英文标题：The highly efficient NDH‑dependent photosystem I cyclic electron flow pathway in the marine angiosperm Zostera marina

关键字：环式电子传递、NADPH脱氢酶复合体、放氧复合体、跨膜质子梯度、大叶藻

过量辐射引起的光合器官的光氧化损伤是影响陆生和海生植物的主要胁迫因子之一。光氧化损伤会破坏ATP和NADPH产生的化学计量平衡，植物必须对ATP和NADPH进行非常精确的动态控制，以维持高效的光合作用，满足植物不同的代谢需求。通过调整线性电子(LEF)到光系统I循环电子 (PSI-CEF)的速率，ATP /NADPH比值可以被灵活地调整到所需的水平。当由两个光系统驱动的LEF从水到NADP+时，O2在氧进化复合体(OEC)发生进化，同时产生NADPH和ATP。作为一种补充机制，PSI-CEF催化电子从PSI受体转移到质体醌(PQ)，使光化学激发的电子通过cytb6f复合物和PC返回到PSI，而不需要净生成任何基质还原剂。在这个过程中，质子被从基质中取出并泵入到类囊体腔，产生了跨类囊体的质子梯度(△pH)，并通过CF0F1-ATP合酶通道驱动ATP合成。因此，PSI-CEF的活性被认为有助于平衡由光反应产生的ATP/NADPH的比例。

在被子植物中至少提出了两种备选的PSI-CEF通路。主要途径是涉及质子梯度调节5 (PGR5)和类PGR5光合显型1 (PGRL1)的抗霉素a敏感途径。次要途径是由对鱼藤酮敏感的叶绿体NADPH脱氢样(NDH)复合物介导的。拟南芥突变体实验发现PGR5/L1和NDH依赖的循环电子传递对跨类囊体膜质子梯度分别贡献30%和5%。叶绿体NDH复合体是位于类囊体基质中的一种多蛋白复合体，最初是通过与线粒体呼吸电子传递中的复合体I同源而发现的。迄今为止，在叶绿体NDH复合体中共检测到29个亚基，其中包括五个亚复合体:膜亚复合体、亚复合体A、亚复合体B、腔内亚复合体和电子供体结合亚复合体。叶绿体NDH复合体缺乏氧化NAD(P)H的亚基，但有与Fd位点链接的供体连接亚复合体，NAD(P)H将电子经Fd传递给NDH复合体继而还原PQ库。

目前提出了依赖NDH的PSI-CEF的三个主要功能：(1)通过下调通过cytb6/f复合物的电子输运以酸化类囊体腔来启动光保护，并在PSII中诱导非光化学猝灭的qE组分来消散吸收的多余光能；(2)在各种严重胁迫条件下，通过保持ATP/NADPH的高输出比来保护光合器官免受基质过度还原的伤害；(3)产生额外的ATP来驱动蛋白质修复，满足植物的各种代谢需求。然而，叶绿体NDH复合体的生理功能可能因物种、处理条件、生长环境等有所不同。已有研究表明，NDH依赖的PSI-CEF损伤不影响整体光合作用，说明NDH依赖的PSI-CEF在稳态光合作用中不是必需的，虽然它在波动环境下的光合调节中发挥作用。一般认为NDH依赖的PSI-CEF不参与弱光条件下的光合作用，但最近的一项研究表明，水稻的NDH复合体缺失可以在弱光条件下降低碳同化速率和植物生物量积累。绝大多数的海洋植物(Peltier和Cournac 2002)，以及一些陆生高等植物，如所有种类的球根植物和松科植物，以及部分种类的兰科和天竺葵科植物，均未检测到NDH基因编码。缺乏NDH复合体，表明该复合体的功能可有可无，可能存在一些替代或补偿的电子传递途径弥补其功能。相反，NDH复合体在某些物种中的存在可能提供一个关键的选择优势，使光合反应能够适应环境压力。大多数海洋植物的NDH复合体的缺失可能与它们相对稳定的海洋栖息地有关。

大叶藻属(Zostera marina, Zosteraceae)，又称eelgrass，是一种广泛分布的海草物种，由陆地单角类的淡水祖先进化而来，并成功地过渡到完全淹没的海洋分类单元。在进化过程中，基因组的缺失和扩增现象频繁发生，为其海洋生活方式所需的结构和生理适应提供了遗传变异。根据氨基酸序列的多重比对，发现大叶藻具有完整的29个编码叶绿体NDH亚基的基因，即使在海洋被子植物中也很少见。分类与大叶藻同目的波喜荡草属（Posidonia）和根枝草属（Amphibolis）未检测到编码叶绿体NDH复合体的基因。因此，叶绿体NDH复合体在Z. marina的作用需要探索。在本文中，我们提出了在Z. marina中高效的NDH依赖的PSI-CEF，这可能与OEC失活以及光合性能的维持有关。此外，我们提供的证据表明，在过量辐照下依赖NDH和依赖PGR5/Li的PSI-CEF之间存在此消彼长的动态变化。

—— 材料和方法 ——

植物材料

在位于中国山东半岛北侧的荣成(37°16′N, 122°41′E)3 m深度的次潮汐海草床上采集到根茎系统完整(6-9节间)的健康大叶藻。在2019年5月连续几天的下午晚些时候进行采样。大叶藻在实验前在过滤海水水族馆预培养3天，在15℃和100μmolm-2s-1，以10:14-h的光：暗周期进行照明。根据最小饱和光强度，照明由A型LED灯提供，色温范围6000 K。从叶鞘上方2厘米处采集叶片进行实验测量，以保持相同的年龄。

进化分析

基于29个NDH亚单位的串联序列，采用MEGA 5.0程序构建系统发育树，并进行了1000次重复的bootstrap测试。这30个物种的所有这些序列都是通过BLASTP分析从国家生物技术信息中心(NCBI)检索到的。交互式生命树(http:// url .embl.de/)用于对树进行注释和修饰。

光处理和抑制剂处理

暗适应过夜的大叶藻暴露在三种不同的光强度，50,300和600μmolm-2s - 1反应3小时。这些处理在下文称为弱光（LL）、中光（ML）和强光（HL），它们通过德国DUAL-PAM-100来测量最小饱和光强来确定。所有处理均在光照培养箱(GZP-250N，上海森欣实验仪器有限公司)中进行，控制海水温度为15℃，模拟其在自然环境中的生长状态。光由A型LED灯提供，色温范围6000 K。在测定荧光动力学之前，随机选取暴露于光照下的叶片，每隔20分钟至暗适应15分钟。Antimycin A (AA, Sigma)和rotenone (Aldrich)分别用于抑制PGR5/L1和NDH依赖的PSI-CEF。分别以甲醇和二甲亚砜为溶剂，制备了AA和鱼藤酮原液。处理后样品的溶剂浓度低于1% (v/v)。叶片使用过滤海水或含1μM AA, 150μM鱼藤酮的海水进行饱和，并在光处理之前，在15℃的黑暗条件下孵育叶片1 h。

叶绿素A荧光和P700测定

利用DUAL-PAM-100测量系统同时测量叶绿素a荧光和P700+吸光度变化。在微弱的调制光下（5μmol m-2s-1）测量出最小荧光值（Fo）后，分别对暗适应和光适应条件下的叶片在300ms的饱和脉冲光下（16000μmol m-2 s-1）测量Fm和Fm’。Fs是光照条件下的稳态荧光值。P700+的信号会在最小（完全还原）和最大（完全氧化）之间变化。最大的变化在P700完全氧化状态(Pm)和一个给定的光状态(Pm’)是在远红光(250μmol m− 2 s−1)和光化光（127μmol m− 2 s−1）预照射后由饱和脉冲光测量。PSII的最大光量子产量：Fv/Fm = (Fm − Fo)/Fm，PSII的电子传递速率：ETRII = 0.84 × PPDF × 0.5 ×( ­Fm’—Fs)∕Fm’，PSI的电子传递速率：0.84 × PPDF × 0.5 ×( ­Pm’—P)/Pm，PSI-CEF：ETRI-ETRII。

暗适应样品在光化光下照射2min，在关闭AL后，我们监测了随后叶绿素荧光的瞬时增加作为NDH活性的一个指标，关闭AL后10 s内测定鼓包的初始斜率。根据Li等人的方法，在暗适应叶片中，当光诱导吸光度在830nm处发生变化时，监测P700+的还原动力学。我们测量P700的再次还原之前采用一个专用校准程序对P700信号进行归一化处理。远红光照射后10 s内测定P700+再还原半衰期缩短(t1/2)，表明PSI-CEF活性升高。

快速OJIP荧光瞬态测量

利用多功能植物效率分析法测定叶绿素荧光快速诱导曲线。由曲线得到如下数据：20 μs的最小荧光值（Fo），最大荧光值（Fm），0.3ms的荧光值（K-step，Fk），3ms的荧光值（J-step，Fj），30ms的荧光值（I-step，Fi）。为了评价PSII的活性，计算了PSII从光子吸收到系统间电子受体减少的能量守恒性能指数(势)：PIABS=4 ×(Fk − Fo) × Fm × (Fm − FJ)/Fv × (FJ − Fo)2，作为PSII供体侧指标监测的k步归一化可变荧光被计算为WK = (Fk−Fo)/(FJ−Fo)。

ECS分析

电致变色效应吸光度信号变化的测量是用DUAL-PAM-100的P515/535模块在515nm波长下进行监测。样品先暗适应15min，再在127μmolm-2s-1的光化光下照射5min，然后再进行测量。AL被关闭，记录ECS的衰变动力学，以确定总ECS，代表了总质子动能(pmf)的大小及其组成部分，即ΔpH和Δψ。ECS衰减(gH+)是通过最初的300ms响应速率到P515发射结束来估计的。

免疫印迹分析

从处理的叶片中分离出叶绿体按照是厂家的指导使用Plants Leaf Chloroplast Rude Divide Kit测量。叶绿素含量测定采用Porra等人的方法。根据Towbin等人的描述，对NdhH、NdhS、PGR5、PGRL1、PsbO、PsbP和PsbQ(Agrisera，瑞典)的抗体进行Westernblot分析。采用Rubisco大亚单位抗体(RbcL, Agrisera，瑞典)作为内参对照。用凝胶对x射线胶片上产生的化学发光带进行密度测量使用图像实验室软件对Doc XR+系统(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)进行量化。每个目标条带的总密度都是基于RbcL密度进行标准化的。

数据分析

采用SPSS 22.0统计软件包进行统计分析。所有参数均采用单因素方差分析。采用Tukey趋势检验进行事后比较。差异有统计学意义P < 0.05。使用Origin9.0程序，采用单指数函数拟合法对P700+再还原的每个点进行拟合。使用线性回归分析来评估WK，PIABS，和鼓包。

—— 结果 ——

NDH复合体的系统发生分析

基于连接的29个NDH亚基序列构建了叶绿体NDH复合体的系统发生树，显示了NDH复合序列在蓝藻、苔藓、蕨类、蕨类和石生植物中NDH复合体的系统发育关系。在蓝藻门，轮藻门和蕨类植物NDH复合物均不完整，并且部分被子植物中也缺失部分NDH亚基的。Z.marina包含五个完整的NDH亚复合物。海洋植物中除了原始藻类之外，绿藻、硅藻、红藻和褐藻等常见藻类都缺少编码叶绿体NDH复合体亚基的同源基因，这表明Z. marina中NDH复合体的存在可能在光合作用中发挥重要作用。

图1 叶绿体NDH复合体的系统发生树

PSI循环电子流的动态变化

以ETRI-ERTII为代表的PSI-CEF的活性在三个水平的照射下逐渐增加。同样，P700+再诱导所示的PSI-CEF活性也随着光强的升高而逐渐升高。这些结果表明，大叶藻PSI-CEF随着光照时间的延长逐渐增强，同时也会随着光照强度的增强而增强。

图2 在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圆形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）处理条件下ETRI-ETRII随时间的变化过程。平均值±SD由四个独立样本计算。采用Tukey趋势检验，差异有统计学意义(P < 0.05)

图3 a在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圆形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）处理条件下P700+再还原半衰期随时间的变化过程。平均值±SD由四个独立样本计算。每个点表示对指数函数的拟合（所有R2值＞0.96）

两个PSI循环电子途径的动态变化

利用光照后叶绿素荧光的瞬时增强来测定NDH依赖的PSI-CEF。如图4a所示，叶绿素荧光在光照后出现了明显的瞬时增强，且这种增强在HL条件下大于ML大于LL光照处理。此外，光照后的初始斜率随着曝光时间的增加而逐渐增大(图4c)，说明NDH依赖的PSI-CEF被显著激活。为了确定处理过量照射的两个PSI-CEF通路的持续响应，我们使用从Z. marina叶子中分离的叶绿体，使用特异性抗体进行免疫印迹分析。针对NdhH亚基的抗体只能识别45kDa的一个多肽，而抗NdhS的抗体只能识别27-kda的一个蛋白。每个样本中，anti-PGR5识别一个15-kda蛋白，anti-PGRL1识别一个29-kda蛋白（图5）。光密度分析显示，NdhH和NdhS蛋白水平所描述的ndh依赖通路活性明显随暴露时间的延长而逐渐增加。相比之下，由PGR5和PGRL1蛋白水平表达的PGR5/L1相关的通路活性在光照开始后的早期最高，随后下降到稳定水平(图5b)，表明PGR5 /l1依赖和nndh依赖的PSI-CEF通路可能在不同的光照期交替作用。

图4 a一种监测NDH活性的经典叶绿素荧光追踪，b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圆形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）条件下照射3h后鼓包的响应。b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圆形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）条件下鼓包的初始斜率随时间的变化过程。平均值±SD由四个独立样本计算。采用T检验，差异有统计学意义(P < 0.05)